1　免疫 1.1　動(dòng)物 選用體重10～12g同性或雌雄性各半的健康NIH小白鼠。 將動(dòng)物隨機(jī)分為三組，每組16只或20只（同性或雌雄性各半，為保證攻擊后有16只或20只小白鼠，可適當(dāng)多免疫幾只小白鼠），同時(shí)飼養(yǎng)健康小白鼠55只，備做對(duì)照用。 1.2　免疫原稀釋 將百日咳原液用生理鹽水或pH7.3±0.1磷酸鹽緩沖生理鹽水稀釋至成品菌苗濃度的1/2，然后再稀釋7.5×、37.5×、187.5×，百日咳參考菌苗稀釋至每ml含8IU，然后再稀釋成每ml含1.0IU（0.125ml）、0.2IU（0.025ml）及0.04IU（0.005ml）。 1.3　免疫方法 將不同稀釋度的免疫原分別免疫小白鼠，每只小白鼠各腹腔注射0.5ml。 2　攻擊菌及攻擊菌液的制備 2.1　菌種 小白鼠腦內(nèi)攻擊用58030（18323）菌株。 2.2　培養(yǎng)基 可用包-姜氏培養(yǎng)基（含羊血20%～30%）或其他適宜的培養(yǎng)基。 2.3　培養(yǎng)溫度及時(shí)間 放35～37℃培育，第一代不超過(guò)72小時(shí)，攻擊時(shí)菌種的培育時(shí)間為20～24小時(shí)。原代菌種放2～8℃可保存2周。 2.4攻擊菌液的制備 將培育20～24小時(shí)的菌苔經(jīng)肉眼檢查為純菌后，刮入生理鹽水或pH7.3±0.1緩沖生理鹽水，用滅菌脫脂棉過(guò)濾，測(cè)定濃度，然后用pH7.0～7.2水解酷素、蛋白胨水或肉湯稀釋成每0.03ml含菌8萬(wàn)，作為試驗(yàn)組的攻擊菌液，然后再連續(xù)稀釋，使每0.03ml分別含8000、800、80及8個(gè)菌，以上5個(gè)不同稀釋度的菌液，作為對(duì)照組的攻擊菌液。 2.5　工作起止時(shí)間 自攻擊菌液制備（開始刮菌）至注射完最后1只小白鼠不得超過(guò)2.5小時(shí)。 2.6活菌計(jì)數(shù) 在攻擊前后，可將0.03ml含8個(gè)菌的攻擊菌液，接種于包一姜氏培養(yǎng)基或其他適宜的培養(yǎng)基平皿中，每個(gè)平皿0.2ml，每次不得少于2個(gè)平皿，其菌落形成單位約為濁度測(cè)定的1/4。 3　攻擊 動(dòng)物免疫后14天，每只小白鼠腦內(nèi)攻擊0.03ml菌液（含8萬(wàn)個(gè)菌），用0.25ml注射器，4號(hào)針頭。在試驗(yàn)組攻擊后再進(jìn)行對(duì)照組毒力測(cè)定，對(duì)照組每稀釋度攻擊10只小白鼠。 4　記錄結(jié)果 動(dòng)物攻擊后觀察14天。攻擊后第2天，將試驗(yàn)組動(dòng)物處理成每組16只或20只。以后逐日觀察動(dòng)物并記錄死亡數(shù)，最初3天死亡的動(dòng)物不作統(tǒng)計(jì)，至第14天有麻痹、頭部腫脹、弓背及明顯聳毛的動(dòng)物按死亡計(jì)算。 5　結(jié)果計(jì)算 5.1　按Wilson-Worcester氏法計(jì)算參考菌苗及待檢菌苗的ED50±SD%，每個(gè)ED50標(biāo)準(zhǔn)差的范圍一般應(yīng)為64%～156%。 5.2　按Reed-Muench氏法計(jì)算對(duì)照組LD50，1個(gè)LD50的菌數(shù)應(yīng)不高于800個(gè)菌。 5.3　計(jì)算均質(zhì)性因子“α”。 5.4IU計(jì)算 待檢原液每ml應(yīng)含IU=參考菌苗ED50/待檢原液ED50×參考菌苗每ml的IU數(shù) 6　效力評(píng)價(jià) 百日咳原液按成品菌苗嘗試稀釋后，每個(gè)接種劑量的免疫效價(jià)應(yīng)不少于4.0IU。